커버슬립은 IF 실험을 위해 시험관내 6주에서 고정되었다. 인간 배아 줄기 세포와 함께 일하는 것은 럿거스 배아 줄기 세포 연구 감독 (ESCRO) 위원회에 의해 승인되었습니다. 상대적으로 고밀도에서 마우스 해마 뉴런 (∼200,000 뉴런/78.5 mm2) 출생 후 일 0-1 C57/BL/6 배경 남성 신생아 새끼에서 격리 되었다 (Maximov et al., 2007; Chanda et al., 2017) 및 배양 후 상이한 시점(4, 6, 8, 10, 12, 및 16d 체외, DIV)에서 고정하였다. 고정은 4% 파라포름알데히드를 실온에서 10분 동안 PBS에서 희석하고, PBS에서 잘 세척하고, 4% 소 혈청 알부민, 1% 정상 염소 혈청 및 0.2% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS에서 30분 동안 투과하여 수행하였다. 커버슬립은 토끼 항시냅신(1:3000, E028, Südhof 실험실로부터의 선물), 토끼 항소포성 GABA 수송기(vGAT; 1:500, Millipore Ab5062P, RRID:AB_2301998) 및 마우스 항-마이크로투튜브 관련 단백질(MAP2; 1:500, 시그마 M1406, RRID: AB_477171 및 1:1000 밀리포어 AB5543, RRID: AB_571049) 1시간 동안 1차 항체, 잘 세척되고, 적절한 이차 항체에서 배양(1:500, 알렉사 플루어 546-접합 항토끼 및 488-컨쥬게이트 항마우스). 모든 단계는 실온에서 실시되었다. 그런 다음 DAPI(Sigma)를 포함하는 플루오로쉴드 미디어를 사용하여 슬라이드에 커버슬립을 장착하였다. 약 101.6 × 101.6 μm2 Z 스택 이미지 (1024 × 1024 픽셀 해상도, 인간 및 마우스 배양에 대한 8 비트 그레이 스케일 깊이)는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (Zeiss LSM-700, Carl Zeiss)에 의해 63 × 수몰입 목표를 사용하여 1 × 디지털 줌으로 획득되었습니다. 시냅토제네시스 타임 코스용 마우스 배양 이미지는 16비트 그레이스케일 깊이로 촬영되었습니다. 모든 이미지는 각 데이터 집합 내에서 동일한 레이저 강도, 디지털 게인 및 오프셋 배경을 사용하여 획득되었습니다.

그런 다음 최대 강도 프로젝션 이미지를 구성하고 이미지를 Intellicount 또는 Fiji에서 분석을 위해 TIFF 형식으로 내보내이미지J(Schindelin et al., 2012)의 고유한 패키지입니다. 서브필드(∼20 × 20 μm2)는 puncta ROI를 식별하기 위해 수동 추적을 통해 분석을 위해 피지를 사용하여 iN 이미지에서 자른 것입니다. 피지-고정 임계값은 하부 임계값에 대해 임계값 설정 55를 사용하고 상한임계값에 대해 255를 사용하여 수행되었다. 피지 내의 수동 및 고정 임계값 분석 방법 모두에 대해 입자 분석을 사용하여 ROI 특성을 분석했습니다. 신경계 기능은 뉴런의 정확한 연결에 의해 결정됩니다. 10,000개의 뉴런을 가진 드로소필라 유충에서 800억 개의 뉴런을 가진 인간에 이르기까지 모든 뉴런은 많은 잠재적인 표적 뉴런 중 시냅스 파트너의 정확한 하위 집합을 식별하는 과제에 직면해 있습니다. 세포 수준에서 특이성 이외에, 신경 회로는 또한 세포 이하 수준에서 시냅스 특이성을 전시합니다 (Yogev와 Shen에서 검토, 2014). Drosophila에서, 거대 섬유 내림차순 뉴런은 빠른 점프 탈출 회로에서 테르고로칸테랄 운동 뉴런의 특정 수지상 도메인을 표적으로 한다(Godenschwege et al., 2002; 고덴슈베게와 무르페이, 2009년).